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分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

文章出處:網責任編輯:作者:人氣:-發表時間:2018-11-26 14:06:00

 作為一種在獸醫診斷領域新興的檢測技術,PCR因其無可比擬的優勢受到了越來越多的關注,也將會引領獸醫體外診斷技術發展的潮流。本文系統性的闡述了分子診斷的優勢以及目前困擾獸醫師們常見的問題。相信通過本文的闡述,可以讓獸醫師們從一個專業、客觀的角度重新認識PCR。

 

體外診斷對于醫療決策至關重要

 

體外診斷對于醫療決策至關重要,據統計,目前全球超過65%的醫療決策是基于診斷信息所作出的。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

體外診斷是指在生物體之外,通過對生物體樣本(血液、體液、組織等)進行檢測而獲取臨床診斷信息,進而判斷疾病或機體功能的產品和服務。體外診斷產品主要由診斷設備(儀器)和診斷試劑構成。隨著現代科學技術的進步,體外診斷技術得到了迅猛發展。

以PCR為代表的分子診斷引領著 體外診斷技術發展的第四次革命

 

縱觀體外診斷技術的發展經歷了四次革命?;瘜W技術的發展(如血液的常規生化檢測)為體外診斷技術帶來第一次革命性的進步,從此,實驗室檢查不僅僅是單純的形態學觀察和描述。

體外診斷技術的第二次革命源于人類對“酶”的認識和酶學技術的發展。如臨床上血清和尿液的淀粉酶、血清乳酸脫氫酶和天門冬氨酸轉氨酶的臨床檢測等。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

免疫學的發展和免疫技術的應用為體外診斷技術帶來了第三次革命。這種采用抗原-抗體結合原理建立的各種檢測方法在臨床上廣泛應用,不僅用于檢測各種腫瘤標記物、自身抗體,還可以用于檢測感染性疾病標志物和激素等。

分子診斷技術的迅猛發展無疑是體外診斷技術第四次革命,分子診斷主要是應用分子生物學方法檢測生物體內遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出的診斷技術,可以從基因層次進行檢測。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

目前,分子診斷技術以其具有的靈敏度高、特異性強、簡便快速、可進行定性、定量檢測等優勢,已廣泛應用于感染性疾?。ò毦愿腥?、病毒性感染、寄生蟲、真菌、人畜共患疾病等)、腫瘤等多個領域。分子診斷的檢測結果對臨床醫療決策的貢獻度進一步提升,檢驗結果的重要性也達到空前的高度。

以PCR為代表技術的是當前分子診斷最常用的簡稱方法。PCR技術是用一對寡聚DNA作為引物,通過變性-退火-延伸這一周期多次循環,使目的DNA得到擴增,具有高靈敏性和高特異性的優勢。

實時熒光定量PCR實現了 PCR從定性到定量的質的飛躍

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

實時熒光定量PCR技術(將熒光基團加入到PCR反應體系中,借助熒光信號,累積實時監測整個PCR的進程)不僅具有傳統PCR的優勢,還具有特異性強、靈敏度高、重復性好、反應速度快、定量準確和自動化程度高等特點,成為國際公認的核酸分子定量的標準方法。

實時熒光定量PCR可以早期 精準的診斷寵物疾病

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

在目前的寵物臨床工作中,廣泛存在著對一部分病原診斷困難或者不能精確診斷的問題。具體表現在以下幾個方面:① 現有的診斷技術靈敏度低,如:常見用于病毒診斷的膠體金試紙。雖然,膠體金試紙可以提供快速診斷,但是該種方法是從蛋白水平對病原進行檢測,存在一定的交叉反應和動物自身抗體干擾,導致臨床應用的過程中出現假陽性和假陰性的結果。②疾病的早期診斷(如潛伏期)和抗原要求較高的疾病,使用傳統的診斷技術(膠體金試紙和ELISA檢測方法)無法提供準確的診斷依據。如臨床上常見犬瘟熱和細小病毒;③ 臨床上有很多的病原沒有商品化的便捷的試劑商業化生產,這一部分的病原診斷(如貓傳染性腹膜炎;)目前在獸醫臨床工作中還不能做到在醫院內診斷。如果需要做血涂片、糞檢的疾病,導致主觀性較強,易產生漏檢的現象。④ 在疫病防治過程中,如注射疫苗是預防犬貓病毒性疾病的主要措施,但是血清學檢測出的抗體很難區別是疫苗免疫還是病毒感染產生的,而PCR能夠精準的檢測病原體。⑤ 臨床上還有一些病原在微量時存在診斷困難的情況,比如小巴貝斯蟲等疾病。因此PCR(尤其是實時熒光定量PCR)使這些疾病的精準診斷成為現實。

因此,農業部《2013年國家動物疫病監測與流行病學調查計劃》的要求,以及我國現行的寵物疾病診斷國家標準中頒布了《犬細小病毒診斷技術(GB/T27533-2011)》《犬瘟熱診斷技術(GB/T27532-2011)》國家技術標準,明確將犬細小病毒和犬瘟熱病毒核酸檢測(而非試紙卡檢測)作為診斷標準,這也說明核酸檢測在動物疫病診斷中的重要地位。

選擇一款合適的PCR對于寵物的診斷尤為重要

 

在臨床工作中,目前有很多PCR供獸醫師們選擇,有核酸免提取的、有等溫擴增的、有液體試劑和凍干試劑的、有全自動PCR,讓獸醫師們無從選擇,到底應該怎樣客觀的看待這些,做到科學的選擇呢,接下來會詳細的闡述。

核酸免提取會導致假陰性的概率增加

 

核酸提取是分子診斷實驗的“第一步”,是十分重要的環節,因為首先必須把寵物樣品中的核酸提取出來,才能進行后續的檢測,可見核酸提取的重要性。核酸提取具有兩大目的:提純(消除樣本中干擾物質)和濃縮(提高樣本中核酸濃度)。因為,對于PCR所檢測樣品(血清、全血、細胞保存液和糞便等)中有很多干擾物和抑制物,核酸含量低,直接檢測核酸難度高,靈敏度差。因此檢測之前,需要將樣品中的核酸裂解,提純并濃縮,也就是核酸提取。這是業界的主流做法。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

比如臨床上一些鼻咽拭子和口腔拭子的洗脫液,成分很簡單,幾乎是生理鹽水+少量分泌物+大量游離的病毒,可以不進行核酸提取直接擴增。貓的皰疹病毒FHV-1用拭子在口鼻采樣就能檢出。如果拭子的洗脫液比較干凈,可以省去提純這一步,但是不經過濃縮,降低了檢測的靈敏度。

此外,復雜樣本必須要進行核酸提取。比如貓的冠狀病毒(FCoV)大多檢測的是貓的腹水,腹水樣本非常粘稠,里面蛋白很多,無法直擴檢測。這種樣本免提取直接擴增就不是靈敏度下降的問題了,而是無法檢測出來的問題。

等溫擴增成本高具有難以定量的缺點

 

等溫擴增儀器簡單,檢測時間快,檢測靈敏度與PCR相仿。但等溫擴增技術多為外國發明,現在還都在專利保護期內,應用尚不普及,研究也不夠充分,試劑成分復雜,成本高,尤其在核酸定量檢測上還遠遠無法與實時熒光定量PCR比擬。

真空凍干技術具有諸多優點是PCR試劑的趨勢

 

PCR的試劑成分包括純化水、引物、聚合酶、Mg2+、dNTP和探針等成分。這些成分混合后,常溫下會逐漸降解失效。所以液體PCR試劑需要分裝到不同的小瓶-20℃保存,用時再解凍配制。因此,試劑的儲運和操作都比較麻煩。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

而真空凍干技術可將試劑內部的水分完全升華掉,同時不破壞有效成分。凍干之后的試劑可以常溫保存,無需冷鏈運輸。使用時加入水就能溶解,然后像正常的PCR試劑使用,因此是PCR試劑的趨勢。

全自動核酸提取擴增是實時熒光定量PCR的一大技術革命

 

傳統的核酸提取方法雖然技術難度不大,但是這些傳統方法都是“手工法”,需要在“超凈工作臺”或者“生物安全柜中”進行,對實驗室的要求較高,操作繁瑣、費時費力,不適合大量樣品的核酸提取,也不適合于臨床(尤其是獸醫師)分子診斷。因此,全自動核酸提取解決了上述的痛點,是PCR技術史上又一大革命。

目前新一代的自動核酸提取技術以納米微粒磁珠分離核酸技術為代表,較上一代的采用離心柱膜法有著明顯的優勢。雖然離心柱膜法只需離心機就可以提取核酸但核酸流失率高,影響靈敏度。

 

分子診斷:獸醫體外診斷的趨勢和制高點

 

 

分子診斷作為體外診斷技術的第四次革命,應用分子生物學方法,檢測患者(寵物)體內遺傳物質結構或表達水平的變化,繼而作出診斷的技術,它為疾病的預防、預測、診斷、治療和轉歸提供了更為準確的信息。較其他檢測方法相比具有不可比擬的優勢。而PCR作為分子診斷最常用的檢測方法,在寵物的臨床診斷中也越來越重要。

 

 

此文關鍵字:獸醫 寵物醫生
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